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Como criar, gerenciar e analisar sua biblioteca de plasmídeos

Por Zareh Zurabyan 3 min de leitura 27 de junho de 2023

No campo das ciências da vida, os plasmídeos, moléculas de DNA de fita dupla autossuficientes, são ferramentas inestimáveis usadas extensivamente em laboratórios para engenharia genética, síntese de proteínas recombinantes, desenvolvimento de vacinas e terapias e análise da função gênica. Devido à sua capacidade de transportar genes específicos e regular sua expressão, os plasmídeos servem como elementos cruciais para o desenvolvimento de terapias genéticas e vacinas, oferecendo controle e seletividade inigualáveis.

No entanto, o gerenciamento de uma biblioteca de plasmídeos em expansão pode ser um desafio, já que alterações mínimas em sua sequência podem ocorrer durante a clonagem, a passagem ou a otimização para aumentar a expressão e a eficiência. Além disso, sua qualidade pode se degradar com o tempo devido ao armazenamento inadequado ou à contaminação. A chave para navegar por essas complexidades é a manutenção rigorosa de registros e protocolos de armazenamento que envolvem identificadores exclusivos, verificações frequentes de qualidade e o uso de bancos de dados digitais, como rastreadores do Microsoft Excel, sistemas dedicados de gerenciamento de informações laboratoriais (LIMS) ou Cadernos eletrônicos de laboratório (ELN). É fundamental ter extrema cautela ao usar esses sistemas, pois qualquer imprecisão no backbone do plasmídeo, na resistência a antibióticos, no marcador de seleção ou nas células bacterianas ideais para transformação pode gerar confusão, erros e um gasto desnecessário de tempo e recursos.

Neste blog, apresentaremos alguns dos plasmídeos comuns usados na área de ciências biológicas e forneceremos algumas práticas recomendadas para criar, manter, gerenciar e armazenar uma biblioteca de plasmídeos.

Os plasmídeos mais usados em P&D

Assim como escolher a ferramenta certa para um trabalho, é fundamental construir uma biblioteca de plasmídeos adequada e adaptada às suas necessidades de pesquisa. Os pesquisadores geralmente têm uma variedade de plasmídeos de base e seus derivados em seu repertório, prontos para uso com base no tipo de experimento planejado. Por exemplo, para entender a função de um gene em um modelo de doença, você pode construir uma biblioteca de plasmídeos que consista em vários domínios funcionais do gene ou variantes sem domínios específicos e com mutações direcionadas. A manutenção de informações organizadas sobre cada plasmídeo, incluindo o backbone, a estratégia de clonagem e a estratégia de purificação, é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis e reproduzíveis.

Diversas variantes de plasmídeos são amplamente utilizadas em pesquisa e desenvolvimento, sendo que algumas das mais populares são os vetores pUC19, pET, pGEX, pBABE e lentivirais. Os vetores pUC19 têm sido fundamentais no sequenciamento de DNA, na produção de proteínas recombinantes, na engenharia genética de culturas e no estudo da genética bacteriana. coli, são conhecidos por seu promotor T7, marcadores de seleção, vários locais de clonagem, etiquetas de fusão e expressão induzível. Os vetores pGEX, por outro lado, são usados para expressar e purificar proteínas recombinantes fundidas com glutationa S-transferase (GST) em E. coli. Os vetores pBABE permitem a transferência retroviral de genes e a expressão estável de genes em células de mamíferos. Por fim, os vetores lentivirais são preferidos para a transferência e a terapia de genes em células de mamíferos, fornecendo uma entrega eficiente de genes, edição de genes e usos potenciais na terapia do câncer e no desenvolvimento de vacinas.

Técnicas de biologia molecular para trabalhar com plasmídeos

Uma infinidade de técnicas de biologia molecular é empregada em laboratórios úmidos para a criação e manutenção de bibliotecas de plasmídeos, cada uma delas adaptada aos requisitos específicos do projeto. Algumas técnicas comumente utilizadas incluem Amplificação por PCRA transformação é um procedimento fundamental que envolve a introdução de plasmídeos em células bacterianas para replicação e manutenção. A transformação é um procedimento fundamental que envolve a introdução de plasmídeos em células bacterianas para replicação e manutenção.

A seleção pós-transformação, baseada em antibióticos ou fluorescência, desempenha um papel fundamental na manutenção de células com plasmídeos. O sequenciamento ajuda a determinar a sequência de DNA de plasmídeos ou bibliotecas, facilitando assim a identificação de genes específicos ou fragmentos de DNA. A extração e a purificação de DNA, abrangendo processos como lise alcalina, precipitação e purificação baseada em colunas ou esferas, são necessárias para isolar o DNA de células bacterianas. Técnicas inovadoras de clonagem, como Montagem Gibson ou montagem Golden Gate também pode ser empregado para a síntese de plasmídeos. A escolha das técnicas mais adequadas para a construção e a manutenção de bibliotecas de plasmídeos depende de vários fatores específicos do projeto, como o tamanho da biblioteca, o tipo de plasmídeos utilizados e as aplicações de downstream pretendidas.

É hora de levar sua biblioteca de plasmídeos para o próximo nível

Criar, gerenciar e analisar uma biblioteca de plasmídeos pode ser complexo, mas com as ferramentas e estratégias certas, você pode criar um recurso sustentável que impulsiona sua pesquisa. Saber como manter, armazenar e gerenciar sua biblioteca de plasmídeos de forma eficaz é fundamental para garantir resultados consistentes e confiáveis em seu trabalho.

Felizmente, elaboramos um guia detalhado intitulado "The Ultimate Guide to Building, Managing, and Analyzing Your Plasmid Library" (O guia definitivo para criar, gerenciar e analisar sua biblioteca de plasmídeos). Esse guia fornece informações abrangentes sobre os seguintes aspectos:

  • Criação de uma biblioteca de plasmídeos sustentável
  • Práticas recomendadas para manter uma biblioteca de plasmídeos
  • Práticas recomendadas para armazenar sua biblioteca de plasmídeos
  • Utilização de ferramentas de software para gerenciamento de sequências e bibliotecas de plasmídeos in silico

Ao utilizar este guia, você pode otimizar suas estratégias, agilizar seus processos e manter sua pesquisa na vanguarda da descoberta científica.

O guia definitivo para criar, gerenciar e analisar sua biblioteca de plasmídeos

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